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Un enfoque práctico de análisis de folato de Glóbulos Rojos Departamento de Ciencias de la Nutrición de la Universidad de Alabama en Birmingham, AL 35294 Correspondencia: Chandrika J Piyathilake, Departamento de Ciencias de la Nutrición, División de Bioquímica Nutricional y Biología Molecular de la Universidad de Alabama en Birmingham (UAB), 1675 University Blvd, Webb 318A, Birmingham, AL 35294. Tel: 205-975-5398; Fax: 205-966-2859; E-mail: ude. bau@cihtayip Derechos de autor & # x000a9; 2007 Los autores. Este artículo es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos y condiciones de la licencia Creative Commons Reconocimiento (http://creativecommons. org/licenses/by/3.0/). Este artículo ha sido citado por otros artículos en PMC. Abstracto Se prefiere la medición de folato en glóbulos rojos (GR), ya que refleja el estado de folato a largo plazo en el cuerpo en comparación con folato en plasma / suero que puede estar influida por la ingesta dietética reciente. La técnica comúnmente aceptada para el análisis de folato RBC implica la preparación de un hemolizado utilizando una muestra de sangre entera fresca. Se necesitan concentraciones de hematocrito y de folato en plasma para calcular los valores de folato RBC. Debido a la necesidad para el acceso inmediato a un laboratorio donde el procesamiento se puede realizar, puede no ser práctico para evaluar el estado de folato RBC usando este método en los estudios epidemiológicos sobre el terreno. Sin embargo, es factible aislar lleno RBSs de una muestra de sangre en estas condiciones. El propósito de este estudio es validar el análisis de folato RBC usando concentrado de glóbulos rojos mediante la comparación de los valores de folato RBC obtenidos por el método de hemolizado (ensayo de rutina) con los obtenidos mediante el uso de glóbulos rojos empaquetados (nuevo ensayo) en los mismos individuos (n = 50) con el ensayo microbiológico de ácido fólico. La correlación entre el folato en plasma y el ensayo de folato RBC rutina (r = 0,58, p = 0,001) y la correlación entre folato en plasma y el nuevo ensayo de RBC folato fue estadísticamente significativa (r = 0,55, p = 0,001). La correlación entre RBC folato por el ensayo de ensayo y nueva rutina también fue estadísticamente significativa (r = 0,78, p & # x0003c; 0,001). Llegamos a la conclusión de que la medición del folato en RBC concentrados es un enfoque práctico para evaluar el nivel de folato a largo plazo en el campo basados en y en estudios epidemiológicos o mayor escala, donde un acceso inmediato a un laboratorio no está disponible para el procesamiento de la muestra necesaria para el ensayo de folato rutina de RBC. Palabras clave: ácido fólico, lleno de RBC, hemolizado Introducción Que circula análisis de folato en la sangre ha sido la prueba de diagnóstico de rutina para la deficiencia de folato durante más de tres décadas. Evaluación del estado de folato también ha sido importante debido a su papel en la reducción del riesgo de enfermedad cardiovascular [1], defectos del tubo neural [2] y el cáncer [3]. Se prefiere la medición de folato en glóbulos rojos (GR), ya que refleja el estado de folato a largo plazo en el cuerpo en comparación con folato en plasma / suero que puede estar influida por la ingesta dietética reciente [4]. La técnica comúnmente aceptada para el análisis de folato RBC implica la preparación de un hemolizado utilizando sangre entera fresca diluyéndolo en recién preparada ascorbato 1%. La incubación del hemolizado en 37 & # x000ba; C durante 20 minutos permite conjugasa plasma endógeno (gamma-glutamil carboxipeptidasa) para convertir poliglutamatos de folato RBC a folatos ensayables. Debido a la necesidad de un acceso inmediato a un laboratorio donde hemolizados pueden prepararse adecuadamente, puede no ser práctico para evaluar el nivel de folato RBC en los estudios epidemiológicos sobre el terreno. Sin embargo, es factible para aislar concentrados de glóbulos rojos de una muestra de sangre en estas condiciones. El propósito de este estudio es validar el análisis de folato RBC usando concentrado de glóbulos rojos mediante la comparación de los valores de folato RBC obtenidos por el método de hemolizado con los obtenidos mediante el uso de glóbulos rojos empaquetados en los mismos individuos. Materiales y métodos Se utilizó 50 muestras seleccionadas al azar que fueron tratados y almacenados de un gran estudio en el que todos los participantes del estudio dieron permiso para utilizar sus muestras en futuros estudios relacionados con la investigación del cáncer. Estas muestras fueron recogidos durante un período de 12 meses. Todas estas muestras se procesaron inmediatamente y se almacenan apropiadamente para evaluar plasma y folato RBC mediante el uso de un método de hemolizado de glóbulos rojos. En pocas palabras, se recogió una muestra de 10 ml de sangre en uno de EDTA (tapa púrpura) del tubo vacutainer. El hematocrito (necesario para calcular las concentraciones de folato RBC) se midió utilizando 25 & # x003bc; l de sangre entera. Después de mezclar 25 & # x003bc; l de sangre total con 725 & # x003bc; l de recién preparada de ascorbato 1% para el ensayo de folato RBC, los restos de las muestras de sangre se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos para separar el plasma de los glóbulos rojos . El plasma se transfiere a un tubo separado y se almacena a & # x02212; 80 & # x000ba; C hasta que se utilizó para el análisis de ácido fólico. la capa leucocitaria se retiró cuidadosamente para eliminar todas las células blancas de la sangre de la muestra. Los glóbulos rojos empaquetados se transfirieron a un tubo de centrífuga y se almacenaron a & # x02212; 80 & # x000ba; C hasta que se usaron para ensayos futuros. En este estudio, hemos utilizado el plasma, hemolizado de glóbulos rojos y glóbulos rojos empaquetados para el análisis de folato de los individuos seleccionados. Preparación de los glóbulos rojos para el análisis de folato Cuando se utilizaron muestras de sangre recién recogidas para el ensayo de folato RBC, la conversión de poliglutamatos de folato RBC a monoglutamatos se logró enzimáticamente por conjugasa folato en plasma después de la incubación de la hemolizado (preparado mezclando 25 & # x003bc; l de sangre total con 725 & # x003bc; l de ácido ascórbico 1% recién preparado) a 37 & # x000ba; C durante 20 minutos. plasma de rata se utilizó como fuente de conjugasa para convertir poliglutamatos de folato en los eritrocitos a monoglutamatos empaquetados. plasma de rata (Harland Bioproducts para Science, catálogo BT-4511) se trató con carbón vegetal activado (Sigma, Catálogo # C-4386)) para eliminar el ácido fólico; 750 mg de carbón vegetal por cada 15 ml de plasma de rata se agitó muy suavemente durante 60 minutos en hielo y se centrifugaron a 3500 rpm a 4 & # x000b0; C durante 5 minutos. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 micras. Después de que el plasma de rata se puso a prueba de ácido fólico para asegurarse de que está libre de ácido fólico, se hicieron alícuotas y se almacenaron a & # x02212; 70 & # x000b0; C. Los experimentos iniciales indicaron que la conversión óptima de poliglutamatos de folato en las muestras de RBC puede lograrse mediante la mezcla de 25 & # x003bc; l de glóbulos rojos empaquetados con 712,5 & # x003bc; l de ácido ascórbico 1% recién preparada y 12,5 & # x003bc; l de plasma de rata (tratado con carbón vegetal) y mediante la incubación de la mezcla a 37 & # x000ba; C durante 30 minutos. Todas las muestras de concentrados de eritrocitos se prepararon siguiendo este protocolo. Ensayo de L. casei microbiológica La adaptación placa de 96 pocillos de L. casei ensayo microbiológico se utilizó para medir los niveles de folato total en las muestras tratadas adecuadamente de RBC y plasma [5, 6, 7]. Brevemente, 20 & # x003bc; se utilizó l de la muestra y el estándar de folato (15 ng / ml) en el ensayo. Los volúmenes de la muestra y del estándar se ajustaron a 300 y # x003bc; l usando tampón de fosfato 0,1 M (pH 8,6) que contiene 10 mg / ml de ácido ascórbico. Seis diluciones seriadas de la muestra y estándar (estándares de folato en el intervalo de 0,005 a 0,15 ng / 0,3 ml de ensayo bien después de diluciones en serie) se hicieron usando un pipeteador de 12 canales. Entonces 150 & # x003bc; l de medio de L. casei que contiene L. casei, a una concentración de 5 & # x003bc; l / 10 ml de medio) se pipeteó en todos los pocillos y se incubó durante 18 horas a 37 & # x000ba; C . Después de la incubación, el contenido de cada pocillo se suspendieron por aspiración repetida y lavado varias veces con una pipeta de 12 canales. El crecimiento bacteriano se midió mediante la lectura de la densidad óptica a 655 nm. Este ensayo se basa en la capacidad del ácido fólico en la muestra para estimular Lactobacillus casei (ATTC 7469) de crecimiento relativo a las normas que contiene folato. El coeficiente de variación y la recuperación de este ensayo se 5% & # x02013; 7% y 96% & # x02013; 105%, respectivamente. Para controlar la reproducibilidad de estos ensayos, dos grupos de muestras (bajo y alto) preparados a partir de plasma obtenido de la Cruz Roja Americana se ensayó al menos 30 veces y los medios y se determinaron las desviaciones estándar. Estos sirven como base para el control de calidad de los ensayos (los ensayos de muestras de estudio se repitieron si los valores de las muestras de control en cada serie fueron más allá de dos desviaciones estándar de la media). Las piscinas bajas y altas se incluyeron en cada placa. Plasma, RBC hemolizado y preparaciones de glóbulos rojos empaquetados de los mismos individuos se sometieron a ensayo para el folato en las mismas condiciones experimentales (la misma placa, el mismo día, etc). Cálculo de RBC folato La siguiente fórmula se utilizó para calcular RBC folato cuando se utilizó el ensayo de rutina. Whole & # x02009; Blood & # x02009; folato & # x02009; (Ng / ml) & # x02212; [X02009 Plasma & #; folato & # x02009; ng / ml (1 & # x02212; hematocrito / 100)] Hematocrito / 100 Esta fórmula hace una corrección para folato en plasma presente en todo el hemolizado de sangre y para la proporción de sangre que consta de RBC. Dado que se utilizan de glóbulos rojos en el nuevo ensayo, no se requiere una corrección para folato en plasma o el hematocrito en el nuevo ensayo. El plasma de rata usado en este ensayo fue tratado con carbón vegetal y se probado no tener folato detectable. Además, el experimento se describe a continuación se realizó para evaluar si la eficiencia de conjugasa plasma de rata es diferente de la de la conjugasa plasma humano. Para llevar a cabo este experimento, las muestras de sangre extraídas de seis individuos se centrifugaron a 3000 rpm / 10 minutos. La capa leucocitaria plasma y se retiraron para aislar RBC. Dos alícuotas de RBC de cada muestra se trataron con plasma de rata o de plasma humano a partir de cada individuo como se describe anteriormente. También se realizó un experimento adicional para determinar si la eliminación de la capa leucocitaria hace una diferencia en los valores de folato RBC. muestras de sangre de seis individuos extraídas en tubos duplicados (5 ml cada uno) fueron utilizados en estos experimentos. Todos los tubos se centrifugaron a 3000 rpm / 10 minutos. El plasma se retira de un tubo de cada individuo dejando la capa leucocitaria y concentrado de hematíes. Desde el otro conjunto de tubos, capa leucocitaria plasma y se retiró dejando sólo los glóbulos rojos empaquetados. RBC con o sin capa leucocitaria se trató con plasma de rata como se describe anteriormente. Análisis estadístico La estadística descriptiva, como media, mediana, desviación estándar (DE) de la media y el rango se calcularon para examinar las diferencias entre el método de hemolizado de glóbulos rojos (rutina) y el método de hematocrito de RBC (nuevo). Se empleó la prueba de rangos con signos de Wilcoxon para determinar la significación estadística de las diferencias entre los resultados de folato obtenidos por las técnicas de rutina y nuevos. Las diferencias entre los valores de folato debido a la utilización de plasma de rata o de plasma humano o de las diferencias de valores de folato debido a la eliminación o salida de la capa leucocitaria se probaron con pruebas estadísticas similares. No paramétrico de correlación (Spearman) se recurrió a análisis determinar la asociación entre los resultados de folato de técnicas de rutina y los nuevos resultados La media & # x000b1; SD y la mediana de RBC folato mediante el ensayo de rutina fue de 449 & # x000b1; 216 ng / ml y 399 ng / ml. La media & # x000b1; SD y la mediana de RBC folato por el nuevo ensayo fue de 366 & # x000b1; 188 ng / ml y 309 ng / ml. La diferencia entre los dos ensayos fue estadísticamente significativa (p & # x0003c; 0,001, Wilcoxon Signed Rango Test). En 43 muestras, los valores de folato RBC fueron mayores con el ensayo de rutina en comparación con el nuevo ensayo y 7 muestras tenían valores de folato RBC más altos con el nuevo ensayo de comparación con el ensayo de rutina. Por encima de todo, con 43 muestras, los valores de folato RBC eran 23% menor con el nuevo ensayo de comparación con el ensayo de rutina. Con 7 muestras, los valores de folato RBC fueron 10% superiores con el nuevo ensayo de comparación con el ensayo de rutina. Los valores altos o más bajos de glóbulos rojos por la nueva técnica en comparación con la técnica de rutina fueron distribuidos de forma desigual en el conjunto de datos. No hubo una asociación inversa entre la longitud de almacenamiento de las muestras durante 12 meses los valores de folato para indicar que el tiempo de almacenamiento más prolongado puede producir valores más bajos de folato RBC por la nueva técnica. La correlación entre el folato en plasma y el ensayo de folato RBC rutina (r = 0,58, p = 0,001) y la correlación entre folato en plasma y el nuevo ensayo de RBC folato fue estadísticamente significativa (r = 0,55, p = 0,001). La correlación entre RBC folato por el ensayo de ensayo y nueva rutina también fue estadísticamente significativa (r = 0,78, p & # x0003c; 0,001, Figura 1). Correlación entre RBC folato medido por el ensayo de rutina y el nuevo ensayo. En promedio, los valores de folato RBC de las muestras tratadas con plasma de rata eran 24% menor en comparación con los valores de RBC de las muestras tratadas con plasma humano y esta diferencia fue estadísticamente significativa (p = 0,03). valores de folato RBC de muestras con la capa leucocitaria tenían valores de folato ligeramente más altos en comparación con las muestras de RBC sin capa leucocitaria, pero la diferencia entre los dos no fue estadísticamente significativa (p = 0,27). Discusión valores de folato se pueden medir utilizando un folato en suero / plasma o un ensayo de folato de células rojas. Un balance de folato negativa observada en los pacientes del hospital se muestran para dar lugar a un valor bajo folato sérico sin deficiencia de folato [8]. Por lo tanto, bajo el folato de células rojas, pensado para indicar deficiencia del tejido, puede ser más importante que un bajo folato sérico en el diagnóstico de la deficiencia de folato. estado a largo plazo de folato también es probable que sea más informativo en la evaluación de su importancia en las enfermedades crónicas tales como afecciones cancerosas o pre cancerosos. Recientemente hemos informado de que una medida combinada de RBC y folato en plasma de estado es un predictor más fuerte de la historia natural (adquisición, la persistencia o la desaparición del virus del papiloma humano de alto riesgo, el principal factor de riesgo de NIC y el cáncer de cuello uterino que folato en plasma por sí sola [9 ]. Estas observaciones sugieren que la evaluación del nivel de folato RBC es importante en los estudios epidemiológicos sobre el terreno. Sin embargo, la necesidad de un acceso inmediato a un laboratorio donde hematocrito se puede medir y hemolizados pueden prepararse adecuadamente es un obstáculo para el uso del folato rutina de RBC ensayo en los estudios epidemiológicos sobre el terreno. por esta razón, las muestras no están disponibles para evaluar el estado de folato RBC en la mayoría Actualmente biorepositories disponibles de los estudios epidemiológicos también, el cálculo de folato rutina RBC requiere que el valor de folato en plasma que aumenta el coste para la evaluación de folato RBC en los estudios de mayor escala. folato RBC evaluación usando RBC concentrados describe en este manuscrito elimina algunas de estas limitaciones. Constatamos también que los glóbulos rojos se pueden almacenar con o sin capa leucocitaria y folato es estable en estas muestras para un período de 12 meses. Hemos observado que las concentraciones de folato RBC en una muestra dada es probable que sea menor cuando se utilizó plasma de rata para convertir poliglutamatos de folato RBC a monoglutamatos en comparación con el plasma humano y esto puede ser debido a la menor eficiencia de plasma de rata en la conversión de poliglutamatos RBC humanos para monoglutamatos. Esto no debería sin embargo, interferir con la interpretación de datos, siempre y cuando el plasma de rata se utiliza con todas las muestras en un estudio dado. Hemos usado este ensayo folato RBC desarrollado recientemente en un estudio epidemiológico grande donde se confirmó que la relación entre un polimorfismo en las concentraciones de la vía y de folato de folato son similares cuando folato se midió utilizando el nuevo ensayo y el ensayo de folato rutina que usa una sangre entera hemolizado [10]. En conclusión, documentamos que la medición de folato en glóbulos rojos empaquetados es un enfoque práctico para evaluar el nivel de folato a largo plazo en el campo de base y en estudios epidemiológicos o mayor escala. Expresiones de gratitud Apoyado en parte por R01 CA105448-01 del Instituto Nacional del Cáncer. referencias [1] Boushey C, Beresford S, G Omenn, Motulsky AG. Una evaluación cuantitativa de la homocisteína en plasma como factor de riesgo para enfermedades vasculares beneficios probables de incremento de la ingesta de ácido fólico. JAMA. 1995; 274: 1049-1057. [PubMed] [2] Centros para el Control de Enfermedades Recomendaciones para el uso de ácido fólico para reducir el número de casos de espina bífida y otros defectos del tubo neural. MMWR. 1992; 41 (RR-14): 1-7. [PubMed] [3] Mason JB, Levesque T. El folato: efectos sobre la carcinogénesis y el potencial para la prevención del cáncer. Oncología. 1996; 10: 1727-1743. [PubMed] [4] Chanarin I. 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